1. 目的：
规范慢病毒滴度检测标准操作程序
2. 范围：
适用于慢病毒滴度检测操作工序
3. 操作程序
3. 1 器材准备
移液枪、 各种枪头， 1. 5mL EP 管、 试管架， 酒精灯、 荧光显微镜、 CO 2 培养箱、 生物安全柜
3. 2 溶液准备
1640 培养基， FBS（gemini），
3. 3 操作步骤
3. 3. 1 检测前一天， 对 293T 细胞传代， 每个 96 孔中加 8000 个细胞， 37 度培养过夜， 感染时细胞长至 30~50％
的融合密度；
3. 3. 2 次日， 准备 10 个无菌的 Ep 管， 每个 EP 管中加入 90 μ L 的培养基（1640 培养基+10% FBS）， 取待
测定的病毒原液 10 μ L 加入到第一个管中， 混匀（用移液枪反复吹吸混匀， 注意不要吹起气泡） 后， 标
记（10
-1 ）， 取 10 μ L 加入到第二个管中， 继续相同的操作直到最后一管（10 -8 ）。
3. 3. 4 选取所需的细胞孔， 吸去孔板中培养液， 加入梯度稀释为 10
-3
至 10
-8 稀释好的病毒溶液 90ul 到孔板
中， 轻轻混匀， 放入 37℃ 5% CO 2 培养箱中培养；
3. 3. 5 24 小时后， 视具体情况更换新鲜完全培养基 90ul。 小心操作， 不要吹起细胞。
3. 3. 6 第四天， 在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量， 病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍
数。
3. 3. 7 例如： 某一慢病毒感染细胞后 96 小时部分孔（某一视野） 的荧光照片如下：
一号孔： 一号稀释液， 含有 10*10-3ml 慢病毒液
二号孔： 二号稀释液， 含有 10 *10-4ml 慢病毒液
三号孔： 三号稀释液， 含有 10*10-5ml 慢病毒液
四号孔： 四号稀释液， 含有 10*10-6ml 慢病毒液
五号孔： 五号稀释液， 含有 10*10-7ml 慢病毒液
六号孔： 六号稀释液， 含有 10*10-8ml 慢病毒液
七号孔： 七号稀释液， 含有 10*10-9ml 慢病毒液
八号孔： 八号稀释液， 含有 10*10-10ml 慢病毒液
某一病毒感染细胞 293T， 六号孔中观察到表达绿色荧光的细胞都至少为 10 个。 则病毒的滴度为： 10 TU/
（10*10-8） ml=1*108TU/ml
3. 3. 8 滴度检测数据分析及结果， 统计相关数据制作慢病毒滴度检测报告。
3. 4 清场
3. 4. 1 物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
3. 4. 2 操作室台面用 75%酒精擦拭消毒后， 开启紫外灯进行灭菌。
3. 5 注意事项
3. 5. 1 梯度稀释过程中， 注意及时更换枪头， 避免交叉污染。
3. 5. 2 做滴度检测的细胞， 铺板前须保持状态良好。